Sekilas tentang Kolom Kromatografi

Pemilihan Column Chromatography

Hal ini didasarkan karena dalam pelaksanannya penelitian ini mengimmobilisasi komponen aktif whey yaitu Laktoperoxidase (LPO) dan Laktoferin (LF). Immobilisasi merupakan langkah untuk meningkatkan efisiensi penggunaan cation exchange. Penggunaan cation exchange yaitu resin merupakan salah satu langkah untuk mengimobilisasi laktoperoksidase agar dapat digunakan berulang kali.

Resin merupakan zat polimer alami ataupun sintetik yang salah satu fungsinya adalah dapat mengikat kation dan anion tertentu. Resin terdiri dari 2 macam yaitu resin kation yang bersifat negatif dan resin anion yang bersifat positif. Laktoperoksidase memiliki pI 9,6 sedangkan Laktoferin memiliki pI 9,2 sehingga cenderung bersifat positif, sehingga resin yang tepat untuk digunakan menangkap laktoperoksidase ini adalah resin kation.

Immobilisasi secara sederhana dapat dilakukan dengan menempatkan cation exchange resin kedalam kolom dan mengalirkan sumber laktoperoksidase dan laktoferin melalui kolom tersebut. Kolom ini nantinya akan diisi dengan resin yang akan mengikat mengikat molekul laktoperoksidase sehingga didapatkan protein murni laktoperoksidase dan laktoferin. Kolom ini terbuat dari kaca dengan diameter 2 cm. Kolom ini akan diisi dengan resin. Resin yang digunakan yaitu ada 3 jenis yaitu Seharose Fast Flow (SP-FF), Sepharose Big Beads (SP-BB), dan Activated CNBr Sepharose (SP-CNBr).

Imobilisasi Komponen Aktif Whey

Imobilisasi merupakan sebuah bagian dari perkembangan bioteknologi yang memacu perkembangan rekayasa enzim. Imobilisasi merupakan suatu metode untuk mengatasi penggunaan enzim secara konvensional kurang menguntungkan dan efisien karena setiap pemakaian ataupun analisis harus menggunakan enzim yang baru. Imobilisasi akan menggunakan matriks yang akan mengikat enzim yang diinginkan sehingga dapat digunakan berulang kali. Pengujian aktivitas enzim yang terimobilisasi terhadap pemakaian berulang bertujuan untuk mengetahui stabilitas enzim tersebut (Sebayang, 2006).

Imobilisasi memberikan manfaat bagi enzim yaitu dapat ditingkatkan aktivitasnya dalam suhu yang tinggi. Immobilisasi komponen di dalam whey seperti laktoperoksidase dapat dilakukan dengan Ion Exchange Chromatography (IEC). IEC ini dapat mempertahankan stabilitas enzim sehingga tahan lama sehingga imobilisasi enzim dengan cara IEC dapat dilakukan secara praktis. Enzim yang didapat, dapat dengan mudah dipisahkan dengan dari produk sehingga dapat digunakan kembali. Teknik imobilisasi lebih efisien untuk memproduksi suatu zat dengan menggunakan enzim (Al-Baarri et al., 2012).

Cara immobilisasi yaitu filtrate whey dengan volume tertentu kemudian dialisis dengan 10mM sodium phosphate buffer (PB) (pH 6,8) selama satu malam. Hasil dari cairan whey tersebut dilewatkan  pada kolom yang berisi resin. Filtrat whey disirkulasikan melalui kolom dengan menngunakan sebuah tabung umpan balik dan pompa peristaltik. Whey yang dialirkan dan disirkulasi pada laju aliran 1 ml/menit Setelah pengeringan whey, resin dicuci dengan 50 ml dari 10 mM  PB (pH 7) yang mengadung 0,1 M NaCl. Untuk perlakuan kontrol cairan whey yang telah dialisis disirkulasikan juga pada kolom dengan laju aliran 1 ml/menit. Setelah pengeringan whey, resin kemudian dicuci dengan 50 ml dari 10 mM PB (pH 7) yang mengandung 0,4 mM NaCl untuk laktoperoksidase dan 1 mM untuk laktoferin. Hasil tersebut kemudian dikumpulkan (5 ml per tabung) dan dibaca pada absorban 280 mn. Penghilangan pada koefisien 280 mn dari 1,5 mg cm ² m-¹digunakan untuk memperkiran konsentrasi LPO di larutan. Kemurnian LPO dan LF ditentukan dengan sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) (Al-Baarri, 2010).

Kesulitan Pelaksanaan

Kesulitan dalam pelaksanaannya yaitu dalam penggadaan resin yang harus diimpor dari luar negeri. Pengambilan sampel susu yang akan dibuat menjadi whey membutuhakan penanganan khusus yaitu pengambilan langsung dari sapi perah dan langsung didinginkan. Pengolahan menjadi whey juga harus homogen agar LPO dan LF yang akan dihasilkan dapat sesuai dari sampel yang didapat. Banyak peralatan yang membutuhkan ketelitian tinggi seperti mikropipet, makrocup, mikrocup dll. Selain itu refrigerator dibutuhkan dalam pelaksanaannya, serta freezer untuk mengawetkan LPO dan LF. Laboratorium yang steril juga dibutuhkan di sini. Inti dari semuanya yaitu alat dan bahan yang digunakan harus sesuai, agar data yang diperoleh dapat sesuai yang sebenarnya.

Referensi

Al-Baarri, A. N., Ogawa, M. & Hayakawa, S. 2010. Scale-up studies on immobilization of lactoperoxidase using milk whey for producing antimicrobial agent. Journal of the Indonesian Tropical Animal Agriculture. 35: 185–191.

Al-Baarri A.N.,  M. Ogawa, T. Visalsok, S. Hayakawa. 2012. Lactoperoxidase immobilized onto various beads for producing natural preservatives solution. J. Aplikasi Teknologi Pangan. 1(1):4-6.

Sebayang, F. 2006. Imobilisasi Enzim Papain dari Getah Pepaya dengan Alginat J. Komunikasi                   Penelitian 18 (2) : 34-38.